产品货号：
RFT331
中文名称：
非变性PAGE DNA电泳试剂盒
英文名称：
DNA Native-PAGE Electrophoresis Kit
产品规格：
45T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制各种浓度的PAGE胶，使用方便。
非变性PAGE电泳是研究DNA构象变化的常用手段，在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链PCR片段构象多态性（SSCP-PCR）的重要研究手段。在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象，即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同，甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA在非变性PAGE中得到分离。另外，非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA，与琼脂糖电泳相比，对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。
保存：按标签指示条件保存，有效期一年。
本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶，1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶，1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。
10% APS配制-5mL：
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中，彻底溶解后分装，1mL/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
一、制备凝胶
以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶
二、电泳
三、染色
相关搜索：非变性PAGE DNA电泳试剂盒，DNA电泳，PAGE电泳，非变性，凝胶制备，PAGE胶制备，DNA Native-PAGE Electrophoresis Kit
非变性PAGE电泳是研究DNA构象变化的常用手段，在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链PCR片段构象多态性（SSCP-PCR）的重要研究手段。在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象，即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同，甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA在非变性PAGE中得到分离。另外，非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA，与琼脂糖电泳相比，对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。
| 组分 | 规格 | 保存 |
| 30%PAA(29:1) | 100mL | 4℃ |
| 5×TBE | 500mL | RT |
| APS（干粉） | 5mL | RT |
| TEMED | 0.5mL | 4℃，避光 |
| 6×Native-PAGE DNA上样缓冲液 | 1mL | 4℃ |
保存：按标签指示条件保存，有效期一年。
本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶，1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶，1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。
10% APS配制-5mL：
将0.5g APS干粉溶于5mL灭菌水中，彻底溶解后分装，1mL/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
一、制备凝胶
以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶
- 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
- 按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
- 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整。
- 静置10～20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合
表一：TBE-PAGE分离胶配方表(总体积5mL，适用于厚度1.0mm小板胶)
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。最佳DNA分离范围 凝胶浓度 各组份体积（ml） 灭菌水 30%PAA(29∶1) 5×TBE 10%APS TEMED 70～450bp 6% 3 1.0 1.0 0.05 0.005 60～460bp 8% 2.66 1.34 1.0 0.05 0.005 50～300bp 10% 2.33 1.67 1.0 0.05 0.005 40～200bp 12% 2 2.0 1.0 0.05 0.005 25～150bp 15% 1.5 2.5 1.0 0.05 0.005 5～100bp 20% 0.66 3.34 1.0 0.05 0.005 - 去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
表二：TBE-PAGE 4%浓缩配方表(总体积1.5mL，适用于1.0mm厚度胶)凝胶浓度 各组份体积（ml） 灭菌水 30%PAA（29：1） 5×TBE 10%APS TEMED 4% 1.0 0.2 0.3 0.02 0.002 - 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
- 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
二、电泳
- 1×TBE电泳液配制：取100mL 5×TBE，加蒸馏水400mL，即配成500mL 1×TBE。将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。用1mL吸头冲洗加样孔1～2次。
- 取待测样品，加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液，如5μL样品加1μL上样液，短暂离心后取5～10μL上样。TBE-PAGE中判断双链DNA大小可以选择20bp DNA ladder(20～500bp，货号：RFT312)作为DNA Marker。
- 连接电源线，打开电源开关。200 V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达凝胶三分之二位置时结束电泳。
TBE-PAGE电泳 恒电压 起始电流 结束电流 电泳时间 200 V 20-25 mA/板胶 10-15 mA/板胶 70+min
三、染色
- 漂洗：玻璃板上拆下凝胶后，适量蒸馏水漂洗3～5分钟。
- 染色液配制：TBE-PAGE胶可以使用EB或RealGood类染料后染染色，以下程序用RealGood Red核酸染料进行染色。即用型染色液配制：
100mL即用型RealGood核酸染色液 1×TBE 100mL RealGood Red核酸染料 20μL - 染色：凝胶浸泡于即用型染色液中，常温避光摇床40～60rpm染色30分钟。
- 为何SSCP-PCR带型有复合条带？
- 可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
- 可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4～8倍后使用。
- 可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
- 如何提高电泳分辨率？
可以在配胶时加入甘油（终浓度为5%～10%），因为甘油是弱变性剂，能部分展开DNA折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合常温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。
| DNA在PAGE中的有效分离范围 | ||||||
| PAGE浓度 | DNA有效期分离范围 | 二甲苯菁 | 溴酚蓝 | 二甲苯菁 | 溴酚蓝 | |
| %(w/v) C3.3 | 双链bp | 单链nt | 染料迁移率相当于双链DNA片段粗略大小 | 染料迁移率相当于单链DNA片段粗略大小 | ||
| 3.5 | 1000-2000 | 750-2000 | 460 | 100 | 150 | 45 |
| 5.0 | 80-500 | 200-1000 | 260 | 65 | 130 | 35 |
| 8.0 | 60-400 | 50-400 | 160 | 45 | 75 | 19 |
| 12.0 | 40-200 | 30-300 | 70 | 20 | 55 | 15 |
| 15.0 | 25-150 | 10-150 | 60 | 15 | 52 | 10 |
| 20.0 | 6-100 | 8-120 | 45 | 12 | 50 | 8 |
相关搜索：非变性PAGE DNA电泳试剂盒，DNA电泳，PAGE电泳，非变性，凝胶制备，PAGE胶制备，DNA Native-PAGE Electrophoresis Kit